作者：黎志萍，赵伟康，徐品初，陈方敏，金国琴，姚明忠
【关键词】 肝细胞
［摘要］目的：观察益气、活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因表达的影响。方法：以自然衰老大鼠为衰老模型，采用RTPCR、Western blotting法研究益气、活血方药对老年大鼠肝脏p16、p21、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、cyclin D1和cyclin E mRNA转录和蛋白表达的影响。结果：老年大鼠肝脏p16、p21、cyclin D1 mRNA转录和蛋白的表达增加；PCNA、cyclin E mRNA转录和蛋白的表达降低。与老年大鼠比较，益气、活血方药可下调老年大鼠肝脏cyclin D1 mRNA转录和蛋白表达，上调促进增殖基因cyclin E mRNA转录和蛋白表达，但对p16、p21和PCNA的调节作用不明显。结论：益气、活血方药主要通过调控cyclin D1和cyclin E mRNA转录和蛋白表达而促进细胞增殖。
［关键词］衰老大鼠; 肝细胞; p16; p21; 增殖细胞核抗原; cyclin D1; cyclin E; 益气方; 活血方
Effects of recipes for replenishing qi and activating blood on senescence related gene expressions in the liver of aging rats
ABSTRACT Objective: To observe the effects of recipes for replenishing qi and activating blood on p16, p21, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), cyclin D1 and cyclin E gene expressions in the liver of aging rats. Methods: A recipe for replenishing qi and a recipe for activating blood were administered to aging rats respectively, and the effects of the above recipes on the expressions of senescence related genes (p16, p21, PCNA, cyclin D1 and cyclin E) were examined by RTPCR and Western blotting methods. Results: The expressions of p16, p21 and cyclin D1 mRNAs and proteins in the liver of the untreated aging rats were upregulated, while the expressions of PCNA and cyclin E mRNAs and proteins decreased. As compared with the untreated aging rats, both recipes could downregulate the expressions of cyclin D1 mRNA and protein and upregulate the expressions of cyclin E mRNA and protein, but had no obvious effects on the expressions of mRNAs and proteins of p16, p21 and PCNA. Conclusion: Recipes for replenishing qi and activating blood can improve the liver cell proliferation of aging rats via downregulating the expressions of cyclin D1 mRNA and protein and upregulating the expressions of cyclin E mRNA and protein.
KEY WORDS aging rats; hepatocytes; p16; p21; proliferating cell nuclear antigen; cyclin D1; cyclin E; qibenefiting recipe; bloodactivating recipe
随着细胞及分子生物学的发展，已经发现一些与细胞衰老密切相关的基因及转录因子（反式作用因子）［1～3］。纵观历代中医文献，延缓衰老的方药基本属于补肾、健脾、益气和活血范畴。近代研究显示：上述四类方药均有不同程度抗自由基、调节免疫功能、提高肝脏蛋白质含量、改善肝脏超微结构等延缓衰老的作用［4］。实验研究还表明：补肾方药能促进老年大鼠肝脏cHras、cmyc、cfos、cjun mRNA的表达，下调p53 mRNA的表达［5］。本实验从细胞增殖调控角度，根据中医理论，从益气活血的抗衰经典方中分别选择几味有代表性的中药组成小复方，以自然衰老大鼠为衰老模型，应用RTPCR和Western blotting法研究益气、活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因p16、p21、cyclin D1、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和cyclin E表达的影响。
1材料与方法
1.1实验中药 益气方选用党参、黄芪、炙甘草（取自《时氏医道》保元汤），活血方选用川芎、当归、赤芍（取自经方四物汤）。中药制剂采用水提醇沉法制备后，分装于消毒好的塑料瓶中，于－20 ℃保存。
1.2实验动物 SD雄性大鼠（上海中医药大学实验动物中心提供）24只，分成青年对照组（5月龄）、老年对照组（22月龄）、老年益气组（22月龄）和老年活血组（22月龄）。老年益气组和活血组的用药剂量为临床成人剂量的20倍（按每千克体质量的用药量进行换算），采用饮料方式给药，每周服药5 d，停药2 d，自18～22月龄连续给药4个月。
1.3RTPCR 肝组织细胞总的RNA按Trizol一步法提取，具体步骤按试剂说明书操作。βactin PCR引物［6］：5’CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG 3’，5’GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA 3’，扩增片段为378 bp；p16 PCR引物：5’ATGGAGTCCTCTGCAGATAG 3’，5’TTAG CGCTGCTTTGGGGGTT 3’，扩增片段为480 bp；p21PCR引物：5’ATGTCCGATCCTGGTGATGT3’，5’GGGCTTTCTCTTGCAGAAGA 3’，扩增片段为495 bp；cyclin D1 PCR引物：5’ATGGAACACCAGCTCCTGTG 3’，5’TGGTGTTCCATGTCGGTGG 3’，扩增片段为888 bp；PCNA PCR引物：5’ATGTTTGAGGCACGCCTGAT3’，5’AGATCCTTCTTCATCTTCGA 3’，扩增片段为786 bp；cyclin E PCR引物：5’AAAGAAGAAGGTGGTTCCGA 3’，5’TCATTCTGTCTCCT GCTCAC 3’，扩增片段为1 191 bp。PCR扩增反应总体积为50 μl。扩增程序为：95 ℃（30 s）→ ［变性94 ℃（30 s）→退火55 ℃(30 s)→延伸72 ℃ (30 s)］×30个循环→72 ℃ （7 min）→4 ℃贮存。根据目的片段的长短及引物的Tm值设置退火温度及延伸时间。PCR产物鉴定电泳，紫外灯下观察，图像分析系统扫描。
1.4Western Blotting 采用放射免疫沉淀测定法(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)［7］。取肝脏组织100 mg加入单去污细胞裂解液900 μl，冰浴中匀浆。匀浆后立即加入100 μl蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟液(phenylmethylsulphonyl fluoride, PMSF)和40 μl混合蛋白酶抑制complete液(complete EDTAfree protease inhibitor cocktail tablet, 1片加1 ml水），4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，取上清液于－70 ℃冷冻保存。24 h后10 000 r/min离心10 min，取上清液分装，－70 ℃冷冻保存。Lowry (FolinCiocalteau)法［8］测定蛋白含量。各组蛋白各取30 μg，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)和免疫印迹反应，用Supersignal ECL发光剂荧光显色X光胶片曝光，观察蛋白条带。
1.5图像处理及统计分析 RTPCR、Westernblotting实验结果分别采用Leica Q500IW和上海复日Smartview 2001生物电泳图像分析系统进行图像分析。所有实验数据均采用SPSS 9.0统计软件进行统计处理，统计学方法采用方差分析及q检验。
2结果
2.1益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因mRNA表达的影响与青年组比较，老年大鼠肝脏p16、p21、cyclin D1基因mRNA的表达明显上调（P<0.01），PCNA和cyclin E mRNA的表达明显下调（P<0.01）。与老年组比较，益气、活血方药组cyclin D1基因mRNA的表达明显下调（P<0.01），而cyclin E mRNA的表达则明显上调。益气、活血方药对p16、p21和PCNA mRNA的表达有改善作用，但无统计学意义。见图1、图2、表1。
2.2益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因蛋白表达的影响与青年组比较，老年大鼠肝脏p16、p21、cyclin D1基因蛋白表达明显上调（P<0.01），PCNA和cyclin E蛋白表达明显下调（P<0.01）。与老年组比较，益气、活血方药组cyclin D1基因蛋白表达明显下调（P<0.01），而cyclin E蛋白表达明显升高（P<0.01）。见表2、图3。
图1 p16和p21琼脂糖凝胶电泳（略）
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of p16 and p21
M: Marker; 1:Young control group; 2: Untreated group; 3: Qibenefiting recipetreated group; 4: Bloodactivating recipe treated group
图2 cyclin D1、PCNA和cyclin E琼脂糖凝胶电泳（略）
Fig 2 Agarose gel electrophoresis of cyclin D1, PCNA and cyclin E
M: Marker; 1: Young control group; 2: Untreated group; 3: Qibenefiting recipetreated group; 4: Bloodactivating recipetreated group
表1 益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因mRNA表达的影响（目的基因/βactin）（略）
Tab 1 Effects of qibenefiting and bloodactivating recipes on mRNA expressions of p16, p21, PCNA, cyclin D1 and
cyclin E genes in the liver of rats (target gene/βactin)
*P<0.05,**P<0.01, vs young control group; △△P<0.01, vs untreated group
表2 益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因蛋白表达的影响（目的基因/βactin）（略）
Tab 2 Effects of qibenefiting and bloodactivating recipes on protein expressions of p16，p21，PCNA，cyclin D1 and
cyclin E genes in the liver of rats (target gene/βactin)
**P<0.01, vs young control group; △△P<0.01, vs untreated group
图3 p16、p21、PCNA、cyclin D1和cyclin E蛋白印迹杂交结果（略）
Fig 3 Western blotting results of p16, p21, PCNA, cyclin D1 and cyclin E genes
1:Young control group; 2: Untreated group; 3: Qibenefiting recipetreated group; 4: Bloodactivating recipetreated group
3讨论
衰老是生物体在其生命的后期阶段所出现的进行性、全身性、内在性，由多因素共同作用的循序渐进的退化过程。近年来从基因水平研究衰老过程已成为衰老机制研究中的热点。已经发现：有些细胞增殖调控相关基因，主要是原癌基因、抑癌基因及端粒酶调控相关基因等，在年轻和衰老细胞中的表达明显不同。原癌基因是一组参与细胞增殖和生长调控的基因。细胞衰老时，多数原癌基因的表达水平降低，少数升高。由于原癌基因表达产物大多是信号传导途径或细胞周期蛋白相关成员，它们的表达水平降低或活性减弱，会使细胞对刺激的反应性降低，或使细胞周期进程减慢，从而降低细胞增殖水平。抑癌基因的主要功能是对细胞分裂和生长进行适当抑制，防止细胞周期失控导致无限扩增和分裂生长。衰老时，有些抑癌基因的表达或活性增加。具有细胞增殖调控功能的衰老相关基因包括p21、p16、细胞周期素（cyclin）D1、周期素依赖性激酶(cyclindependent kinases, CDK) 2、p53、视网膜母细胞瘤（retinablastoma, Rb）基因和PCNA等。上述衰老相关基因的调控是相互联系的［9］。
中医认为人体的生长、发育和衰老与“肾”密切相关。“肾精虚衰”是衰老的主要原因。同时又认为“脾胃为血气阴阳之根蒂”，“脾胃既和，其人寿；脾胃不和，其人夭”，因此也重视奉养脾胃精气在延年中的作用。《素问・至真要大论》还提出“气血正平，长有天命”，气血运行失常，则能影响脏腑、经络、阴阳等方面功能的平衡，出现五脏六腑各方面病变，加速衰老过程。因此纵观历代文献有关“耐老”、“不老”方药，研究其治法基本属于补肾、健脾、益气、活血范畴。
本实验主要在比较补肾、健脾、益气、活血方药对衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞2BS细胞增殖调控作用的基础上，进一步观察益气、活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因p16、p21、cyclin D1、PCNA和cyclin E的mRNA转录和蛋白表达的影响，以探讨益气、活血方药对老年大鼠肝脏细胞增殖的作用机制。结果表明：老年大鼠肝脏p16、p21、cyclin D1基因mRNA和蛋白表达明显升高；PCNA、cyclin E mRNA和蛋白表达明显降低。提示：老年大鼠肝脏细胞周期蛋白依赖的激酶抑制因子p21、p16表达增高，可能通过抑制cyclin D1CDK4和cyclin ECDK2的活性，使Rb蛋白磷酸化水平降低，从而抑制细胞增殖。p21还可能与PCNA结合，使DNA合成受阻。由于细胞不能进入增殖周期，最终发生衰老。细胞周期蛋白cyclin D1是原癌基因的表达物，与CDK4结合后，可促进G1/S期转变。文献报道：衰老时cyclin D1蛋白水平升高，但cyclin D1CDK4复合物活性降低，影响细胞增殖［10］。本实验结果显示：衰老大鼠肝脏cyclin D1的升高与文献报道一致。PCNA为DNA聚合酶δ的附属蛋白，参与DNA复制；cyclin E与CDK2结合，参与G1/S期的转变。本实验结果显示：与青年鼠比较，老年大鼠PCNA和cyclin E的表达明显下调，则必然影响细胞周期的正常运行，抑制细胞增殖。益气、活血方药能不同程度降低老年大鼠肝脏cyclin D1基因mRNA和蛋白的表达，上调肝脏cyclin E基因mRNA和蛋白的表达，但对p16、p21、PCNA mRNA和蛋白的表达作用不明显。结合本实验室前期实验流式细胞仪检测细胞周期的结果（益气、活血方药可降低老年大鼠肝组织细胞G0/G1期比例，增加G2/G1期细胞比值），提示益气、活血方药可促进老年大鼠肝组织细胞的增殖［11］。益气、活血方药还能不同程度提高2BS衰老细胞的代谢活力和降低衰老相关半乳糖苷酶的活力［12,13］，推测益气、活血方药促进老年大鼠肝组织细胞增殖的作用可能部分与下调cyclin D1、上调cyclin E mRNA和蛋白的表达有关。
［参考文献］
1Cristofalo VJ, Volker C, Francis MK. Agedependent modifications of gene expression in human fibroblasts［J］. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 1998, 8(1): 4380.
2McConnell BB, Starborg M, Brookes S, et al. Inhibitors of cyclindependent kinases induce features of replicative senescence in early passage human diploid fibroblasts［J］. Curr Biol, 1998, 8(6): 351354.
3Smith JR, PereiraSmith OM. Replicative senescence: implications for in vivo aging and tumor suppression［J］. Science, 1996, 273(5271): 6367.
4杨美玲, 周吉燕, 徐维蓉. 益气、补肾、活血、健脾四组方药对老年大鼠肝脏形态学变化影响的比较研究［J］. 中国中医药科技, 1996, 3(6): 2728,34.
5姚明忠, 顾文聪. 固真方对老年大鼠肝脏原癌基因和抗癌基因表达的影响［J］. 中国中西医结合杂志, 1997, 17(基础理论特辑): 67.
6Nakajimalijima S, Hamada H, Reddy P, et al. Molecular structure of the human cytoplasmic βactin gene: interspecies homology of sequences in the introns［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 82(18): 61336137.
7J. 萨姆布鲁克, E.F费里奇, T. 曼尼阿蒂斯著, 金冬雁, 黎孟枫译. 分子克隆实验指南［M］. 第二版. 北京: 科学出版社, 1992. 867897.
8F. 奥斯伯主编, 颜子颖, 王海林译. 精编分子生物学实验指南［M］. 第三版. 北京: 科学出版社, 1998. 329333.
9Bandyopadhyay D, Timchenko N, Suwa T, et al. The human melanocyte: a model system to study the complexity of cellular aging and transformation in nonfibroblastic cells［J］. Exp Gerontol, 2001, 36 (8): 12651275.
10FukamiKobayashi J, Mitsui Y. The regulation of cyclin D1 expression in senescent human fibroblasts［J］. Exp Cell Res, 1998, 241(2): 435444.
11俞仲毅, 赵伟康. 益气活血方药对衰老大鼠肝脏细胞增殖和凋亡的影响［J］. 中西医结合学报, 2004, 2(3): 196198.
12陈方敏, 赵伟康, 徐品初, 等. 补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞增殖的调控作用［J］. 中药药理与临床, 2003, 19(1): 2628.
13陈方敏, 赵伟康, 徐品初, 等. 补肾、益气、健脾、活血法对衰老细胞周期基因表达的调控作用［J］. 中国中西医结合杂志, 2003, 23(11): 837840.
