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冷却肉特定腐败菌群体感应的研究进展

  肉类富含水分、蛋白质、脂肪等营养成分,在加工、贮藏、运输和销售过程中易受微生物污染,发生腐败。其中特定腐败菌(specific spoilage organism,SSO)的大量繁殖产生异臭味和有毒有害物质是引起肉类腐败的关键因素[1]。近年来,大量研究表明,群体感应(quorum sensing,QS)现象在各类食品变质过程中被发现,食品腐败菌的致腐性受QS系统的调控[2],这一发现为食品贮藏保鲜提供了新的思路。对肉中的SSO的QS进行调控可以控制其腐败进程,因此,研究肉中SSO的QS系统是探究肉品腐败变质影响因素的关键,对于靶向抑菌及保障肉品质量安全具有重要意义。本文围绕微生物导致的肉类腐败问题,介绍细菌QS系统,分析QS对冷却肉腐败的调控作用,探讨群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitor,QSI)的研究进展,以期为肉类新型保鲜技术提供指导。
  1 肉类腐败与SSO
  冷却肉在生产和流通过程中,一直处于0~4 ℃低温环境下,大部分微生物,特别是致病菌和嗜温菌的生长受到抑制,但仍会受到一些嗜冷菌污染,这些微生物的大量生长繁殖最终导致冷却肉腐败变质,生成胺类、硫化物、醛、酮、酯和有机酸等,产生不良气味。肉类腐败主要由分解蛋白质、脂肪的腐败菌引起,肉中SSO的构成除了受到冷却肉初始污染菌种类和数量影响外,还与其加工、贮藏环境和包装方式有关,在有氧冷藏条件下,肉的SSO主要为嗜冷性革兰氏阴性菌,如假单胞菌(Pseudomonas)和肠杆菌(Enterobacteriaceae)。此外,不动杆菌属(Acinetobacter)、莫拉氏菌属(Moraxella)也是造成冷却肉腐败的主要微生物[3]。低氧条件抑制了需氧菌的增殖,气调和真空包装冷却肉的SSO主要包括腐化不动杆菌(A. putrefaciens)、热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)、肠杆菌(Enterobacteriaceae)和乳酸菌(Lactobacillus)等[4]。
  2 QS现象与QS系统
  QS现象是1970年由Nealson等[5]在一种海洋发光细菌费氏弧菌(Vibrio fischeri)中发现的,并由Fuqua等[6]在1994年最早提出QS的概念。现已证明,QS普遍存在于微生物中,是微生物之间密度依赖性的信息交流传递机制[7],这种机制由细菌自行分泌的小分子信息素,即自诱导物(autoinducer,AIs)调控。当细菌数量达到一定密度时,能够自发地产生并释放AIs,菌体自身能够感知这种物质浓度的变化,并控制基因表达,从而调节微生物的群体行为[8]。AIs是一类特殊、微小、可扩散的化学分子,又被称为信号分子。在某一特定的环境中,若细菌的数目迅速增多,其分泌的AIs浓度也会随之增高,因此AIs的浓度通常反映了细菌细胞的密度。当AIs的浓度达到一定阈值时,菌体中相关基因的表达启动,从而调控一些生物行为,如被膜产生、毒素分泌、生物荧光和抗生素合成等[9],表明该微生物群体已具备了足够的能力进行集体“作战”,QS系统不仅能指导某一群体的生命活动,还可以调节某些微生物与其他微生物之间的关系,这也是该系统备受关注的原因之一。   QS系统不是一套单一的系统,其包括多种不同的类型。不同菌体的QS系统不同,调控基因表达的自体诱导物也不同,且具有较高的特异性。依据其利用的自体诱导物的不同可分为以下几种类型:1)以酰基高丝氨酸内酯(acylhomoserine lactone,AHLs)介导的革兰氏阴性菌QS系统,革兰氏阴性菌主要以AHLs为信号分子(AI-1)[9];2)寡肽类(autoinducing peptides,AIPs)介导的革兰氏阳性菌QS系统,革兰氏阳性菌一般通过AIPs进行信息交流[2];3)呋喃硼酸二酯(furanosyl borate diester,AI-2)介导的种间QS系统,在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均存在,通过其细菌可感知其他细菌的数量进而调控自身行为,是不同种类细菌间进行“交流”的媒介[10];4)其他类信号分子介导的QS系统,这些信号分子主要包括喹诺酮信号(pseudomonas quinotone signal,PQS)分子、扩散信号因子(diffusible signal factor,DSF)、羟基-棕榈酸甲酯(hydroxypalmitic acid methyl ester,PAME)等。
  由于冷却肉的SSO多为革兰氏阴性菌,因此与之密切相关的是AHLs介导的QS系统。该系统由合成AHLs的LuxI蛋白和转录因子LuxR蛋白兩部分构成。该系统产生的信号分子AHLs可自由穿透细胞壁与细胞膜,并在环境中累积,当AHLs浓度达到临界值时,与转录因子LuxR蛋白结合,生成的复合物LuxR-AHLs能激活目的基因转录,从而引起细菌产生各种生理反应[11]。目前,已在70多种革兰氏阴性菌中发现LuxI/LuxR系统模式。AHLs是一类小分子水溶性化合物,由一个高丝氨酸内酯(homoserine lactone,HSL)环和一个酰胺侧链组成,其区别主要在于酰胺链的长度不同(碳原子数为4~18 个)以及第3位上取代基(氢、羟基、羰基)不同[12]。不同种类细菌产生的AHLs分子不同,而同一种细菌可能产生多种AHLs分子。
  3 QS对冷却肉腐败的调控
  研究表明,QS对冷却肉SSO的调控主要在胞外蛋白酶、生物膜等致腐因子的形成中起作用[13]。胞外蛋白酶是肉类SSO主要的代谢产物之一,也被认为是肉类重要致腐因子,微生物对肉类腐败变质的作用很大程度上是由于蛋白质不断被微生物降解利用而引起的。腐败菌蛋白酶的分泌受QS系统的调控,如产气单胞菌(Aeromonas)分泌的AHLs可以与AhyR蛋白结合,调控胞外蛋白酶的生成[14]。微生物形成生物膜,黏附于物体表面且难以清除,可以抵抗逆性环境,增强自身对抗生素、环境及宿主免疫系统的耐受能力,是导致腐败菌持续污染肉品的重要因素之一。Fazli等[15]发现,铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)等多种微生物的成膜过程受QS系统的调控。
  研究者从冷藏牛肉、猪肉、鸡肉等的腐败变质过程中检测出AIs。Mellor等[16]从鸡肉中分离出的荧光假单胞菌(P. fluorescens)能够产生生物表面活性剂,有助于腐败菌更好地利用高脂肪肉中的营养成分。Jay等[13]研究表明,在5~7 ℃条件下有氧贮藏的鲜牛肉中SSO为假单胞菌属(Pseudomonas),且腐败变质过程中发现了QS现象。Bruhn等[17]从真空包装腐败肉中提取出AHLs,证明蜂房哈夫尼亚菌(H. alvei)能够分泌C6-HSL,并通过QS系统调控同一环境中其他菌种的生长代谢,进而影响肉的腐败。Liu等[18]发现,当假单胞菌(Pseudomonas)数量达到8~9 (lg(CFU/g))、肠杆菌(Enterobacteriaceae)达到3~4 (lg(CFU/g))时,牛肉和鸡肉中可检出C4-HSL、C6-HSL、C6-3-oxo-HSL、C8-HSL、C12-HSL等信号分子,且AHLs的活性与假单胞菌(Pseudomonas)蛋白酶的活性之间没有明显的相关性。Blana等[19]从牛肉、鸡肉和火鸡肉中均测到AI-2活性,气调包装牛肉源乳酸菌(Lactobacillus)可用自身分泌的AI-2调控气调包装牛肉中的SSO。Gram等[20]研究发现,当肉制品中肠杆菌(Enterobacteriaceae)达到一定数量时,AHLs分子可以促使肠杆菌酶的产生,从而加速肉制品品质劣变。Skandamis等[21]发现,肉源莓实假单胞菌(P. fragi)能分泌AI-2,但不能产生AHLs。
  4 肉类腐败菌QS的抑制
  QSI是指能够抑制微生物QS现象,而不干扰细菌正常生理活动的生物活性物质。通过干扰腐败菌的QS系统阻断细菌细胞的信息交流,使之所调控的腐败基因不表达,从而在不造成生长压力的情况下降低腐败菌的致腐能力,从而达到防腐保鲜的目的[22],这种基于QS抑制的策略为食品保鲜技术研究开辟了一条新的思路。
  4.1 QSI的作用机制
  QSI主要有以下3 种作用途径[23]:1)抑制AIs的合成。通过抑制AIs前体物合成或抑制合成酶活性来阻断AIs的生成,如二氯苯氧氯酚被证实可以限制AHLs类分子脂酰-ACP的生物合成而干扰AHLs的组装[24];姜油酮可抑制铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)AHLs合成酶的活性,进而阻碍生物被膜的形成[25];2)促进AIs的降解。利用酶类对AIs进行降解或淬灭,已在细菌中发现许多能够降解AHLs的淬灭酶,如AHL-内酯酶能破坏AHLs的高丝氨酸内酯环使之失活,AHL-乙酰转移酶使AHLs上N-酰基碳链上的酰胺键水解,氧化还原酶类降解AHLs侧链基团从而使AIs失活[26];3)抑制AIs与受体蛋白的结合。研究发现,吡哆醛乳酰腙可与LasR的多个活性位点结合,从而干扰铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)中QS相关毒力因子的表达[27]。   4.2 QSI的来源及其应用
  QSI按照来源不同可分为天然QSI和人工合成QSI,天然QSI又分为微生物源QSI、植物源QSI及海洋生物源QSI等,人工合成QSI主要有呋喃酮类、取代HSL类、内酯类和其他类型化合物。天然QSI无毒副作用,是当前的研究热点。
  4.2.1 微生物源QSI
  AHL-内酯酶、AHL-酰基转移酶、脱氨酶及脱羧酶等降解AHLs的酶主要来源于原核生物。QS淬灭酶是从芽孢杆菌(Bacillus)240b1中筛选得到的N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AiiA),它可以有效减弱胡萝卜软腐欧文氏菌(E. carafavora tear)的致病性。对氧磷酶-2可水解3-oxo-C12-HSL信号分子,以抑制铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的QS系统[28]。真菌类产生的抗生素也具有QS抑制作用,青霉菌能够产生棒曲霉素和青霉酸。黑木耳产生的天然染料能够抑制紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)紫色杆菌素的生成[29]。
  4.2.2 海洋生物源QSI
  多样化的海洋生物是筛选QSI的丰富来源,研究者已从软珊瑚、海绵、海藻、柳珊瑚、硬珊瑚、苔藓虫以及海鞘中发现了QSI。从海洋红藻中提取卤代呋喃酮是最早发现的海洋生物产生的QSI,它能通过减弱转录过程中LuxR蛋白中DNA的结合能力抑制哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的AI-2活性,并且通过竞争性结合AHLs受体阻断QS系统,抑制生物发光[30]。紫杉状海门冬藻产生的十二酸磺酰乙酯可降低AIs的活性,抑制细菌
  毒力[31]。从巨大鞘丝藻中分离出的鞘丝藻内酯干扰紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的QS系统,鞘丝藻酸可以影响铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)毒力因子的产生[32]。
  4.2.3 植物源QSI
  多种蔬菜、水果、香草及香辛料提取物在亚抑菌浓度下均有抗QS活性,目前在冠花、大豆、大蒜、睡莲、番茄、豆苗、豆芽、甘菊、香草和中药材等植物中已提取出QSI,其主要成分为酚、醌、皂苷、单宁、香豆素、萜与生物碱类等[33]。例如,丁香酚具有良好的抗铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的las群体感应系统与抗紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)QS活性[34]。肉桂醛及其衍生物可干扰大肠杆菌(Escherichia coli)生物膜的形成,并抑制不同弧菌属中AI-2介导的QS[35]。百里香精油能明显抑制荧光假单胞菌(P. fluorescens)KM121的运动性及生物膜形成能力[36]。茶多酚在3.125 mg/mL条件下对紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)表现出QS抑制作用[37]。Vasavi等[38]研究发现,用白藜芦醇处理过的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)PAO1菌株的生物被膜对抗生素的敏感性增强。Vikram等[39]通过实验发现,黄酮类化合物,如柚皮素、山奈酚和槲皮素能抑制哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)BB886菌株生物发光。槲皮素和柚皮素还能抑制哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)BB120和大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7菌株生物被膜的產生。香芹酚可干扰铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)生物被膜的形成和绿脓菌素的产生,3.9 mmol/L的香芹酚对绿脓菌素的抑制率为60%[40]。
  其中,植物源QSI因其具有来源广泛、安全无毒等优点受到广泛关注。但植物源QSI与化学保鲜剂相比价格高、稳定性差,且有效成分尚不明确,因此目前QSI仅限于实验研究,并未真正应用于实际生产。研究者通常将植物源QSI与气调包装、紫外杀菌、辐射保鲜等其他保鲜技术相结合,发挥不同保鲜技术之间的协同效用,并与现代冷链物流技术相结合,达到较好的保鲜效果。此外,由于肉类SSO、货架期及货架期内品质与初始微生物种类、数量等密切相关,因此应加强原料肉生产加工卫生管理,并结合多种保鲜技术,才能保障肉品质量安全。
  5 结 语
  由微生物引起的腐败变质是影响冷却肉质量安全的重要因素,减缓冷却肉腐败变质、延长货架期是肉类企业的迫切需求。对肉类腐败菌的QS机理进行深入探究,通过各种信号干扰阻断QS信息的传导,实现对微生物致腐现象的靶向抑制,己成为肉品保鲜领域的研究热点。然而,QS相关研究还存在一些问题亟待解决:
  1)目前,对腐败菌QS的研究主要是利用单一细菌进行纯培养,然而由于肉品体系复杂,菌相呈多样性,腐败菌的种类、数量和生长状态受其他微生物的影响,且细菌产AIs的特性与环境、培养条件等因素有关,其产生的AIs的种类及活性与单一菌体纯培养时存在较大差异。因此,应进一步研究肉品在不同加工、贮藏环境中腐败菌的消长规律以及环境条件、共生菌对腐败菌产AIs特性的影响。2)由于肉类腐败过程伴随pH值的上升,导致AHLs稳定性下降甚至降解,从而使QS对腐败菌致腐性的调控能力降低。此外,Smith等[41]发现,肉中某些细菌,如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、芽孢杆菌属(Bacillus)、希瓦氏菌属(Shewanella)和大肠杆菌(Escherichia coli)等能够降解或窃取AI-2和AHLs。因此,深入探究冷却肉贮藏条件对腐败菌及AIs的影响对理清肉品腐败与QS之间的关系非常重要。3)截至目前,人们对于QS抑制机制的研究尚处于初级阶段,QSI作用于一种或多种QS系统的控制位点仍不清楚,有待进一步研究。此外,由于QSI的复杂性和多样性,仍需深入解析不同来源QSI分子的结构及其作用,从而为QSI的开发应用提供依据。   隨着人们对肉类腐败菌QS及其调控作用研究的深入,基于QS的靶向抑菌技术将成为生物防控领域的发展趋势,对提升肉类品质具有重要的经济效益与社会价值。

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