Preparation and primary application of monoclonal antibody against benzylpenicillin
[Abstract] AIM: To develop monoclonal antibody(mAb) against benzylpenicillin and to establish a Sandwich ELISA method for relative quantitative analysis of the allergen which induced penicillin allergy commonly in clinic. METHODS: Penicillin, as a kind of hapten, was conjugated with carrier protein to form complete antigen and then was used to immunize BALB/c mice. Hybridoma cells secrecting mAb against penicillin were developed. Ascites from the immunized mice were purified by caprylic acid? ammonium sulfate precipitation. The specificity of the purified antibodies was detected and the suitable antibodies were used for establishing Sandwich ELISA. RESULTS: Nine hybridoma cells stably secrecting mAb were prepared through cell fusion, screening and cloning, and five of these purified mAb had relative high affinity. The double?antibody Sandwich ELISA for relative quantitative analysis of benzylpenicilloyl protein was established with a sensitivity of 870U/L.The average recovery rate was 107.81% and the average intra? and inter?coefficient of varitation (CV) was 6.7% and 9.3% respectively. The method was applied for relative quantitative analysis of benzylpenicilloyl protein from Group A Streptococcus Preparation. CONCLUSION: Nine hybridoma cell strains stably secreting mAb against benzylpenicillin were obtained. The double?antibody Sandwich ELISA for relative quantitative analysis of benzylpenicilloyl protein was established.
[Keywords]benzylpenicillin;benzylpenicilloyl;mAb;double?antibody Sandwich ELISA
[摘 要] 目的: 制备抗青霉素的单克隆抗体(mAb)并建立双抗体夹心ELISA检测方法, 对临床上引起青霉素过敏反应的过敏原青霉噻唑蛋白进行研究。方法: 将半抗原青霉素和载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠, 应用杂交瘤技术建立稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株。常规制备腹水, 用辛酸?硫酸铵法纯化, 并对纯化的mAb进行特异性鉴定。通过对不同抗体组合的分析和条件的优化, 建立检测过敏原的双抗体夹心ELISA方法。结果: 经细胞融合、 筛选及克隆化, 共获得9株稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株, 其中5株亲和力较高。建立了双抗体夹心ELISA相对定量检测方法, 该方法灵敏度达到870U/L, 平均回收率为107.81%, 批内变异系数平均为6.7%, 批间变异系数平均为9.3%, 可用于A群链球菌制剂中青霉噻唑蛋白的检测。结论: 成功地制备了抗青霉素的mAb, 并建立了相对定量检测青霉噻唑蛋白的双抗体夹心ELISA法。
[关键词]青霉素; 青霉噻唑基; 单克隆抗体; 双抗体夹心ELISA
青霉素因其高效、 低毒的特点在临床上被广泛应用, 但其结构中的β?内酰胺环很不稳定, 在溶液状态尤其是碱性条件下易开环与蛋白、 多肽的氨基发生亲核反应生成稳定的青霉噻唑蛋白, 形成临床主要的过敏原[1]。青霉素类抗生素的过敏反应发生率居各种药物之首[2], 青霉素不纯物0.01 μg即可使青霉素高度敏感者产生严重的过敏反应[3]。生理条件下青霉素开环后大约95%与蛋白质共价结合形成青霉噻唑基（benzyl penicilloyl, BPO）主要抗原决定簇, 而其他一些共扼物如penicillanyl, penicillenate、 青霉烯酸、 penamaldate, penaldate, D?青霉胺和penicoyl等则为次要抗原决定簇, 后者仅占5%[4]。理论上连接有两个青霉噻唑基的蛋白、 多肽就可能与IgE分子形成桥式结构从而引发I型超敏反应。青霉素的这种不稳定性使得在制备过程中添加有青霉素的生物制品以及食品中都可能残留有青霉噻唑蛋白, 而目前的检测方法通常是针对游离的有抗菌活性的青霉素, 尚无专门针对具有免疫原性且有潜在致敏危险的青霉噻唑蛋白的检测方法。本研究中, 采用杂交瘤技术制备了稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞, 并建立了相对定量检测青霉噻唑蛋白的双抗体夹心ELISA法, 该方法特异性强、 灵敏度高, 有望对药品、 食品中可能残留的青霉噻唑蛋白进行痕量检测。
1 材料和方法
1.1 材料 青霉素钾标准品, 为本所制备,相对分子质量（Mr）为372.49, 纯度为99.9%; 牛血清白蛋白（BSA）、 卵清蛋白（OA）、 多聚赖氨酸（Poly?L?Lysine, PLL）为Sigma公司产品; DMEM培养液为GibcoBRL公司产品, 新生牛血清购自杭州四季清公司; HAT、 HT、 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、 Ig亚类试剂盒均购自Sigma公司, PEG4000购自Fluke公司, BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Pierce公司, 所用二抗均为Jakson公司产品, 其余均为国产分析纯试剂。Sp2/0细胞由本所细胞室提供, BALB/c 雌鼠（6~8周龄）由本所实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 完全抗原的制备 ①免疫原的制备:参照Haan的方法[5], 将25 mg青霉素钾溶于pH9.6 Na2CO3缓冲液中, 充分混匀后加入5 mg牛血清白蛋白BSA（或卵清蛋白OA）, 调节pH值至11, 37℃搅拌过夜, 在0.01 mol/L PBS中充分透析至透析液中不再检出有抑菌活性。将透析物分装于-20℃保存。②筛选用包被抗原的制备: 用直链结构的多聚赖氨酸（Poly?L?Lysine, PLL）与青霉素偶联成BPO?PLL, 方法同①。
1.2.2 BALB/c小鼠的免疫 分别用两种载体偶联的免疫原免疫小鼠, 每只20μg, 皮下多点及四脚掌初次免疫; 14 d后相同剂量腹腔加强免疫, 每2周加强1次, 加强后每隔7 d眼眶采血, 分别测定针对半抗原和载体蛋白的抗体效价, 于细胞融合前3 d尾静脉加强免疫。
1.2.3 细胞融合、 筛选及克隆 按照常规法PEG融合[6]。分别用BPO?PLL、 PLL作为包被抗原和对照抗原（均为1 mg/L包被）、 工作浓度兔抗鼠二抗, 用间接ELISA检测上清液。以免疫小鼠的血清为阳性对照, 以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照, 以细胞培养板中未长出克隆的细胞培养液上清为阴性对照, 选取P/N值最高的采用有限稀释法进行3或4次克隆。每次克隆后对扩大培养建库的细胞上清再分别用阴性对照PLL、 BSA、 OA和检测用抗原BPO?PLL、 BPO?BSA、 BPO?OA包被, 间接ELISA检测。
1.2.4 腹水诱生及mAb纯化 建株细胞扩大培养后常规法制备腹水并采用辛酸?硫酸铵法进行纯化。经还原SDS?PAGE电泳检测纯度, BCA试剂盒测定纯化抗体浓度。
1.2.5 mAb特性鉴定 ①亚类测定: 按照Sigma亚类测定试剂盒说明书测定。②效价的检测: 采用间接ELISA法测定。③相对亲和力的比较: 采用间接ELISA法, 加入倍比稀释的抗体与包被抗原反应30 min, 以mAb浓度对A450值作图, 根据反应曲线以达到50%最大结合的mAb的浓度来比较相对亲和力。④mAb特异性分析: 用Western blot检测。分别将BSA、 OA和BPO?BSA、 BPO?OA以合适浓度进行SDS?PAGE电泳, 转膜（15V恒压, 20 min）后脱脂奶粉封闭过夜。加入合适浓度的纯化抗体, 室温孵育1 h, 洗后加入工作浓度的碱磷酶标记的羊抗鼠二抗室温孵育45 min, 充分洗涤后用NBT/BCIP显色。⑤交叉反应: 采用竞争ELISA将BPO?PLL偶联抗原以工作浓度包被过夜, 分别将青霉素、 氨苄青霉素、 苯氧甲基青霉素、 邻氯西林、 头孢氨苄、 头孢噻吩、 头孢克洛、 盐酸四环素、 罗红霉素、 氯霉素、 硫酸链霉素从10 mg/mL开始进行10倍系列稀释至1 ng/mL, 与等体积合适浓度的mAb 4℃温育过夜, 取100 μL加入抗原包被板中37℃温育1 h, 加入二抗, 显色。计算各种抗生素的IC50并比较交叉反应率, 计算公式: 交叉反应率＝（青霉素IC50/各种抗生素IC50）×100%。
1.2.6 双抗体夹心ELISA方法的建立 （1）最佳抗体组合和工作浓度的确定: 将亲和力和效价均较高的5株抗体采用改良过碘酸钠法标记HRP再两两配对, 一株作为包被抗体, 一株为酶标抗体, 选用BSA偶联青霉素的全抗原为标准抗原（以BSA含量计算, 1 ng/mL定义为1 U/mL）, 选择高浓度30 U/mL、 低浓度2 U/mL作为检测抗原筛选出最佳组合。方阵滴定确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度。（2）标准曲线的绘制: 将抗体用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至以上确定的包被浓度, 以100 μL/孔4℃包被16 h, 用5 g/L酪蛋白封闭37℃ 1 h, 洗涤后加入等体积一系列不同浓度标准抗原(128 U/mL开始倍比稀释)用于确定检测范围, 37℃温育90 min后, 洗涤加入以上确定浓度的酶标抗体100 μL/孔, 37℃温育1 h后, 洗涤加TMB底物显色15 min, 终止反应后用酶标仪测定A450值。以抗原标准溶液浓度为横坐标, 其相应的A450为纵坐标, 绘制标准曲线。（3）ELISA测定特异性、 灵敏度、 回收率及重复性: 用建立的ELISA方法分别检测制备的完全抗原及100倍浓度的BSA、 OA; 通过重复32次测定标准曲线的零浓度标准, 以其均值加3个标准差为检测的灵敏度, 代入标准曲线计算。回收率: 在零浓度标准溶液中分别添加已知的标准抗原（高浓度30 U/mL, 中浓度12 U/mL, 低浓度3 U/mL）再进行ELISA检测并计算含量, 根据公式: 回收率=（测得值/真实值）×100%。重复性试验: 选取高浓度32 U/mL, 中浓度16 U/mL, 低浓度4 U/mL的共3份标准抗原溶液, 每份标准溶液同批测定6次, 每份标准溶液每天测定1次, 连续测定6 d, 计算批内变异系数(CV)和批间变异系数(CV), 评价方法的精密度。
1.2.7 在A群链球菌制剂中的应用 建立的方法对国内某厂家A群链球菌制剂中的青霉噻唑蛋白进行检测。该产品是一种在A群链球菌弱毒株中添加大量青霉素作稳定剂的抗肿瘤生物制品。将冻干制品进行适当稀释后充分透析除去游离的青霉素再浓缩至合适的体积进行检测, 以未添加青霉素的A群链球菌全菌体作阴性对照, 根据吸光度值和标准曲线对不同批次的产品中青霉噻唑蛋白含量进行比较。
2 结果
2.1 完全抗原的制备和鉴定 SDS?PAGE电泳显示（图1）, 连接上青霉素的载体蛋白Mr有明显增加, 条带与载体蛋白相比弥散、 脱尾; 应用软件分析Mr估算偶联效率, 分别将制备的完全抗原命名为BPO20?BSA、 BPO6?OA。将完全抗原和载体蛋白分别包被, 用本室保存的兔抗青霉素多抗、 HRP标记羊抗兔二抗采用间接ELISA进行检测, 结果表明完全抗原制备成功。
图1 载体蛋白和偶联产物的SDS?PAGE分析（略）
Fig 1 SDS?PAGE analysis of carrier protein and coupling products
M: Protein marker; 1: BPO?BSA; 2: BSA.
2.2 小鼠免疫效果 载体蛋白使半抗原具有了T细胞表位, 从图2可见小鼠产生了针对青霉素的抗体, 经过几次免疫后效价不断上升。但由于载体蛋白的免疫原性很强, 抗血清中针对载体蛋白的抗体占明显优势。实验发现, 以OA作载体时, 抗青霉素抗体的效价高于BSA作载体时的效价, 并且抗OA抗体效价低于抗BSA抗体的效价, 因此选用BPO6?OA免疫的小鼠进行融合。
