［摘要］ 目的：合成(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，并用于构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨免疫荧光试剂。方法：用PVA作为载体结合BCPDA?Eu3+和生物素?亲和素，以双抗体夹心法原理，结合生物素标记抗体和包被抗体建立PAPP?A时间分辨免疫荧光试剂，并进行方法学评价。结果：成功的合成了活性的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，构建PAPP?A试剂检测灵敏度为0.7 mIU/L；批内变异系数在3.89%～4.96%之间,批间变异系数在7.35%～9.27%之间。结论：合成的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物较高的反应活性，可以用于多种试剂的构建。构建的PAPP?A试剂灵敏度高，具有潜在的临床应用价值。
［关键词］ 妊娠相关血浆蛋白A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素—生物素—聚乙烯胺—4,7二氯磺苯基?1，10啡罗啉?2，9二羧酸—铕复合物；唐氏综合征
Develop A Direct Solid Phase Lanthane Time?resolved Fluoroimmunoassay Reagent of PAPP?Autilizing PVA
Abstract :Objective To develop a direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassayreagent of PAPP?A by synthesizing a complex of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+. Methods Polyvinylamine (PVA) was labeled with biotin?streptavidin and europium chelate of 4,7?bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicarboxylic?acid(BCPDA). Using labeled PVA complex,We designed two?site sandwich time?resolved fluoroimmunoassay of PAPP?A and evaluated assay characteristics of PAPP?A kit .Results We successed synthesizing a conjuagete of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+ and a reagent of PAPP?A. Detection limits achieved were 0.7mIU/L.The calibration curve was linear 0?10000mIU/L.Intra? and interassay imprecision (CV) was 3.89%?4.96% and 7.35%?9.27%.Recovery was 95.8%?104.2%. Conclusions The conjugate of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+ synthesizied was reactive ,highly fouorescent. A sorts of kit could be synthesized ,taking advantage of it. The reagent of PAPP?A was potentially suited for use in clinical with highly analytical sensitivity.
Key words: Pregnancy associated plasma protein A;Direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassay; Streptavidin?biotin?Polyvinylamine? europium chelate of 4,7?bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicarboxylic?acid; Down's Syndrome
妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy associated plasma protein A，PAPP?A)是一种高分子α2糖蛋白，20世纪70年代在孕妇血清中被发现［1］。在孕妇血中主要PAPP?A是胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为200 000~250 000亚基构成。PAPP?A亚基和两个嗜红细胞主要基础蛋白(Proform of eosinophil major basic protein)以二硫键结合而成［2］，在孕妇血中只存在微量游离单体PAPP?A。PAPP?A亚基由1 547个多聚核苷酸构成，包括1个拉长的锌指结构，3个Lin—notch重复序列，以及5个短一致重复序列［3］。在体内PAPP?A是一种蛋白酶，主要针对胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP?4)和胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP?5)起作用。胰岛素样生长因子I(IGF?I)在促进细胞分裂和增殖起重要作用，它主要通过IGF?1受体起作用，IGF?I、II的生物活性受6个高亲和性IDFBP调节［4，5］。PAPP?A主要用于产前筛查唐氏综合征(Down's Syndrome，DS)，迄今医学上对此病尚无有效的治疗和预防措施，只能通过产前筛查防止DS儿的出生，但目前开展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵入性检查,有1%～3%的流产率,且方法繁琐,出报告时间长,不适宜大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。大量报道认为PAPP?A可作为DS胎儿产前筛查的的标志物。在15周～20周通过结合孕妇孕周、超声诊断和Freeβ?HCG可以鉴别65%～75%，但要在3个月～6个月结合AFP、游离E3以及抑制素上述成分可鉴别85%～90%［6］。有文献［7］报道PAPP?A在急性冠状动脉综合征(ACS)的早期诊断有一定的意义，PAPP?A在ACS患者血清含量＜30 mIU/L，同时结构不同于孕妇体内的PAPP?A且存在动态变化，必须利用超灵敏的方法进行检测。国内PAPP?A的诊断试剂大多为ELISA和PerkinElmer公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫分析(dissociated enhance lanthane time?resolved fluoroimmunoassay,DELFIA)试剂，无国产PAPP?A时间分辨荧光试剂。我们利用PVA(聚乙烯胺)作为载体结合BCPDA镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫分析(direct solid phase lanthane time resolved fluoroimmunoassay,DSLFIA)试剂。为提高检测灵敏度和克服BCPDA标记抗体使抗体失活的问题，我们引入了生物素?亲和素(biotin?streptavidin system)系统。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 4,7二氯磺苯基?1，10啡罗啉?2，9二羧酸［4,7?bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicarboxylic acid,BCPDA自制］；纯化亲和素(Streptavidin，SA ，Sigma公司)；硫代琥珀酰亚氨?6生物素氨基?己酯类［Sulfosuccinimidyl?6'?(biotinamido)?6? hexanamido hexanoate，Sulfo?NHS?LC?LC?Biotin， pierce Chemical Company］；聚乙烯胺氢氯化物(Polyvinylamine hydrochloride， PVA,Chemical Dynamics Corp) ；硼酸钠、二甲亚砜(天津化学试剂有限公司)；单克隆抗体根据文献［5］选择Hyb234—5(Statens serum Institut)作为检测抗体，mAb 10E1(HyTest Oy，Finland)作为捕获抗体；PAPP?A标准品和质控品购于PE公司(质控血清：Control1 508 mIU/L，Control2 2 325 mIU/L，Control3为4 952mIU/L)；鼠IgG(晶美公司)。
1.1.2 仪器 Wallac?1420多标记计数仪(Wallac OY，Finland )；HPLC 硅柱TSK?250尺寸排阻柱( BIO?RAD公司)；96白色微孔板( NUNC公司)、亲和素包被板(Innotrac Diagnostics Oy公司)；Amicon可浓缩离心管(Amicon microconcentration units ，MW 30 000 Cut?off)
1.2 方法
1.2.1 BCPDA的制备 参见文献详细步骤［8～10］。
1.2.2 生物素?聚乙烯胺?BCPDA［(Bio)x?PVA?(BCPDA)y］复合物的构建［11］ 用0.5 M的碳酸盐(pH 9.1)缓冲液配制浓度为10 mg/ml聚乙烯胺(PVA)溶液 ，将200 μg NHS?LC?LC?Biotin溶于20 μl碳酸盐缓冲液中，取200 μl上述PVA溶液加入20 μl上述NHS?LC—LC?Biotin溶液中，振荡混匀，室温反应1.5 h(PVA∶Bio=1∶15)，用0.5 M碳酸盐缓冲液将混合液稀释到1 ml，将固体BCPDA研磨成粉末状，先在上述1 ml混合液中加入5 mg BCPDA，用力搅拌，直到溶解，重复加3次BCPDA，5 mg/次，共计20 mg BCPDA，在室温放置5 h～6 h，直到溶液澄清，转移到透析袋中，用0.1 M NaHCO3 5 L透析、过夜、重复透析2次，尽可能除去没反应的BCPDA和生物素。
1.2.3 HPLC纯化(Bio)x?PVA?(BCPDA)y复合物 离心浓缩上述(Bio)x?PVA?(BCPDA)y复合物到0.3 ml～0.5 ml(用Amicon microconcentration units ，MW 30 000 Cut?off)。流动相0.05 M Tris缓冲液(pH 7.70)，控制HPLC流速0.8 ml/min，在325 nm处监测层析液(325 nm为BCPDA最大吸收峰)，上样后，马上收集，(Bio)x?PVA?(BCPDA)y在10管～16管约5 ml左右，取10 μl(Bio)x?PVA?(BCPDA)y层析液加入90 μl水滴入亲和素包被板微孔中，温育30 min，洗板，加入用Tris缓冲液配制的10 M～5 M EuCl3 100 μl，反应10 min，洗板、干燥，用Wallac?1420检测Eu3+的荧光强度，没结合复合物的被洗去了，没结合BCPDA的复合物因无法结合Eu3+而没有荧光，计算标记的PVA，大约每分子结合50个～100个BCPDA分子。
1.2.4 构建亲和素?生物素?PVA?BCPDA ［(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+］复合物［11］ 用0.1M Tris缓冲液(pH 7.8)配制小牛血清白蛋白(BSA溶液)60 g/L，同时加入EuCl3，使Eu3+浓度为10-6 mol/ml，用双蒸水配制亲和素溶液浓度为1 mg/ml，取上述BSA溶液1 ml，加入10 μl亲和素溶液，再加入50 μl的(Bio)x?PVA?(BCPDA)y复合物(通过固相免疫分析，棋盘滴定法确定最佳用量比，步骤略，结果见后)，混匀，55 ℃温育1.5 h，4 ℃保存备用。
1.2.5 (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物反应活性 用生物素化的各种浓度(0 ng/50μl，0.5 ng/50μl，5 ng/50μl，50 ng/50μl，100 ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板(同第7步)，用60 g/L BSA和0.1 mol/L Tris缓冲液(pH 7.8)10倍稀释(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，在板的微孔中加入100 μl稀释后的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，室温反应30 min，洗板、干燥，测量荧光强度(cpm)。本实验是验证复合物的反应活性。
1.2.6 生物素标记10E1抗体［12］ 用二甲亚砜制备硫代琥珀酰亚氨?6生物素氨基?乙酯溶液(10 mg/ml)，将抗体10E1溶于0.1 mol/L硼酸钠溶液(pH 8.8)，每1 mg抗体中加硫代琥珀酰亚氨?6生物素氨基?己酯类溶液210 μg混合，室温放置4 h，在上述溶液中加入20 ml 1 mol/L NH4Cl，室温反应10 min，将反应液进行透析，除去未结合的生物素，将抗体浓度用分析缓冲液配置成8 ng/μl，-20 ℃保存备用。
1.2.7 单克隆Hyb234—5抗体包被96孔微滴定板 将抗体溶于0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 4.9)，配置成5 μg/ml抗体溶液，在每一孔中加入80 μl抗体溶液，室温反应20 h，然后用生理盐水洗3次，然后每孔加120 μl 0.05 M Tris?Hcl 缓冲液(pH 7.4含0.9%生理盐水、0.05% NaN3、0.5%小牛血清白蛋白BSA)浸泡2 h。吸干缓冲液，干燥，密封4℃保存。
1.2.8 样本收集、定标、灵敏度、精密度和回收实验分析过程 选取怀孕8周、9周、11周妇女血清各一份，经PE公司的DELFIA试剂和D&G公司的ELISA试剂多次精确测定，值分别为：P1 863.27 mIU/L；P2 1 273.63 mIU/L；P3 2 727.23 mIU/L。用标准品稀释液(6% BSA?TSA缓冲液：150 mmol/L NaCl、60 g/L BSA、50 mmol/L Tris?HCl，pH 7.8)将标准品稀释浓度为：S0 0 mIU/L(稀释液)、S1 20 mIU/L、 S2 200 mIU/L 、S3 1 000 mIU/L 、S4 5 000 mIU/L 、S5 10 000 mIU/L。标准品定标根据WHOIRP78/610(WHO International Laboratory for Biological standards，Statens Seruminstitut，Denmark)，单位换算：1 000 mIU/L=4.5 μg/ml。在单克隆Hyb234—5抗体包被96孔微滴定板，每孔加入定标液10 μl，作8次平行测量，加入50 μl生物素标记10E1抗体50 μl，混匀，36 ℃，室温反应20 min，洗板6次，加入100 μl 10倍稀释的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，室温反应25 min，洗板6次，吹干，Wallac?1420测量荧光强度(cpm)，取均值，作标准曲线。将S0 0 mIU/L做20次重复测试，计算均值(X)和标准差(s)，以X +2s为试剂的最小检测限。将Control1，Control2 ，Control3 依据定标分析过程，同批测量20次，批间测量12次，用于评价精密度。对收集样本(P1 、P2 、P3 )依据定标分析过程进行测量，然后将Control1、Control2、Control3分别等体积加入P1 、P2、P3中进行测量，用于评价回收实验。
2 结果
2.1 用HPLC纯化(Bio)x?PVA?(BCPDA)y复合物 在10 min～16 min 出现(Bio)x?PVA?(BCPDA)y的吸收峰，没有结合BCPDA的吸收峰在17 min～24 min出现,见图1。
图1 净化（Bio）x－聚乙烯醇（BCPDA）y在高性能液化色谱（TSK－250过滤柱）上的变化图。（略）
流速控制在0.8 ml/min，吸光率325 nm
2.2 用滴定法确定亲和素和(Bio)x?PVA?(BCPDA)y最佳配比 SA量恒定0.01 mg/ml，生物素标记的抗体包被分别浓度为0 ng/孔、0.5 ng/孔、5 ng/孔、50 ng/孔，缓冲液为pH 7.8 Tris?Hcl 0.1M，Eu3+ 10-5 M，(Bio)x?PVA?(BCPDA)y用量从40 μl～55 μl选择最佳值，50 μl复合物荧光强度值(cpm)最佳，如图2。
图2 滴定链球菌，（Bio) x－聚乙烯醇（BCPDA）y在10-3 M Eu3+,0.1 M Tris-Hcl buffer(pH 7.8)缓冲液中的变化，0.01 mg/ml 链球菌，容积变动范围40 μl~55 μl，观察到最佳容积为50 μl（略）
2.3 验证活性 用生物素化的各种浓度(0 ng/50μl，0.5 ng/50μl，5 ng/50μl，50 ng/50μl，100 ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板验证(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物的反应活性，在测定范围内成线性分布，见图3。
图3 IgG维生素定量法标定曲线（略）
2.4 PAPP?A定标曲线及灵敏度 在0 mIU/L～10 000 mIU/L范围内定标曲线为线性分布，见图4。S0标准重复20次检测均值加2个标准差值代入标准曲线，计算出检测限为0.7 mIU/L(数据没显示)。
图4 PAPP-A标定曲线（略）
2.5 批内、批间精密度 对质控血清批内进行20次分析，批间进行12次分析，得到批内变异系数3.89%～4.96%,批间变异系数在7.35%～9.27%之间,见表1。
表1 批内、批间变异系数比较（略）
2.6 回收实验 对收集样本(P1 、P2 、P3 )依据定标分析过程进行测量，然后将Control1、Control2、Control3分别等体积加入P1 、P2、P3中进行多次测量，分别计算回收率95.8%～104.2%,见表2。
表2 回收实验结果比较（略）
3 讨论
临床化学家最关心的问题是分析技术灵敏度，这也是临床诊断试剂的核心。近来，在临床化学检测物质的浓度的范围10-3 mol/L～10-16 mol/L。PCR以及其他的体外扩增技术使DNA、RNA检测方便、高效、特异。不幸的是蛋白不能复制，最敏感的定量方法是依靠蛋白之间的特异性结合如抗原抗体反应。一个提高蛋白检测灵敏度的方法就是信号放大，即在蛋白上标记可以检测的标记物，通过标记物的信号放大而达到更容易检测的目的。时间分辨免疫学技术是80年代迅速发展起来的的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术，其中荧光镧系螯合物具有较大的Stokes 位移(275 nm)，较窄的发射光谱(10 nm)，较长的荧光寿命(10 us～1 000 us)，而被广泛构建时间分辨荧光免疫试剂。临床运用最广泛的是PE公司生产的解离增强镧系时间分辨荧光免疫分析(dissociation?enhanced lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA)试剂 ，它必须使Eu3+与螯合物分离，由于其信号较弱，必须加入增强液来发大信号，操作烦琐且在加样的过程中可能引起外源性的污染，这些弊端影响了它的应用。在1987年，Evangelista和Diamandis合成一种新的螯合物BCPDA，开创了固相时间分辨免疫荧光技术，解决了DELFIA上述问题［8，9］，但是BCPDA的较大分子量、表面特性和直接标记蛋白容易引起蛋白的失活对它应用带来一些问题，解决的办法就是连接一个载体。我们实验中引入了PVA作为载体，连接BCPDA和生物素?亲和素。PVA直接连接蛋白技术难度较大，而生物素标记蛋白技术比较成熟，同时亲和素有4个生物素结合位点，可以起到信号放大作用，而提高检测灵敏度。我们实验中成功的合成了(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，用它去识别生物素标记的抗体(见图3)，结果显示亲和力非常高。实验关键问题是选择SA和(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物最佳比，我们实验中做了7个浓度梯度，选取结合后荧光强度最大的(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物浓度。利用HPLC层析纯后的(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物回收率是68%。通过实验选择最佳检测抗体浓度、生物素化抗体浓度和标本用量。Jackson［13］分析了提高灵敏度的因素即两个关键的因素与最终的结合分析灵敏度相关：我们监测标记分子(放射性同位素、化学发光剂、荧光团)的能力；结合试剂的质量和实验条件，在临床化学存在一种误导是特别敏感的监测方法(化学发光、时间分辨荧光)能获得好的结果。其实这是错误的，如果实验试剂和条件(抗体的亲和性和特异性，固相结合物的自然特性以及清洗效率)不被选择，很难达到理想的检测效果。为达到较高的灵敏度，需要选择高灵敏度的标记技术、高亲和力的试剂和最好的分析条件(可将试剂的非特异性结合降到最小)。利用镧系螯合物的时间分辨荧光免疫分析是一种高灵敏的标记技术，关键是实验条件的选择，我们验证不同孵育时间下，(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物产出率，以及和生物素化抗体的结合能力(数据不能显示)。经过大量的实验选择了Eu3+的浓度，使其能和BCPDA形成最佳比例(数据不能显示)。反应条件的建立中，我们筛选实验反应温度(18 ℃～56 ℃，每5 ℃选择一次)和反应时间(10 min～24 h)，考虑到临床结果的报告时间，选择了20 min(数据不能显示)。经过实验条件选择，形成了PAPP?A的定标曲线，通过定标曲线确定最低检测限(见图 3)。我们构建的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物可以用于多种像PAPP?A这样利用双抗体夹心法检测的试剂，如AFP等。我们选择构建PAPP?A主要考虑到我国产前筛查项目的自产试剂较少，而且DS筛查尤为重要，由于科研经费的问题，没有进行最佳单抗配对实验，只是参考了国外的相关文献。不过我们实验的核心是构建(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，为以后构建其他试剂做一定的前期工作。我们构建的PAPP?A试剂,回收实验和精密度试验显示，完全满足试剂盒要求。在今后的工作中，我们主要验证(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物和成品试剂盒的稳定性，以及进一步和PE公司的PAPP?A的DELFIA试剂做大量的临床对比实验。总之，我们成功构建了(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物和PAPP?A的成品试剂，它有较高的灵敏度、准确度和精密度，又克服了DELFIA试剂的缺点。
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