［摘要］ 目的 探究抑转丸对Lewis肺癌瘤株转染的C57BL/6小鼠黏附分子CD44V6表达的影响，从而揭示其抗转移机制。方法 将40只小鼠随机分为4组：B、C、D组均造模，造模24 h后C、D组分别以抑转丸小剂量、大剂量悬液灌胃，第21天处死小鼠，检测各项指标。结果 C、D组出瘤时间显著延长（P<0.01）；大、小剂量抑转丸均有对Lewis肺癌生长的抑制作用（P<0.05）；大、小剂量抑转丸均可抑制Lewis肺癌自发转移及降低对C57BL/6小鼠CD44V6的表达（P<0.05）。结论 抑转丸能显著抑制Lewis肺癌的生长与转移，其抗Lewis肺癌转移机制可能与降低CD44V6的表达有关。
［关键词］ 抑转丸；Lewis肺癌；CD44V6；益气活血
抑转丸是根据导师陈光伟主任医师在长期的肿瘤临床工作中，理论联系实际，不断总结得出益气活血为法治疗恶性肿瘤转移复发的经验方基础上研制而成的中药复方制剂。该药由西洋参、莪术、山楂、仙鹤草、鳖甲等中药组成，具有益气活血之功。为探讨抑转丸抑制肿瘤转移复发机制，进一步为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 瘤株：Lewis肺癌；实验动物：C57BL/6小鼠（18~22 g）40只（第四军医大学提供）。
1.2 主要药品及试剂 抑转丸（YZP）由青岛市黄岛区中医院制剂中心提供。YZP配制：大剂量按小鼠36 g/kg（相当于临床用量的3倍），小剂量按小鼠12 g/kg（相当于临床用量）用生理盐水分别配制成3.6 g/ml和1.2 g/ml混悬液；兔抗小鼠CD44V6单克隆抗体（BA 0454），兔抗小鼠CD4单克隆抗体（BA0430），S-P试剂盒（武汉博士德生物工程公司 ）；Buin’s液（自配）。
1.3 主要仪器 解剖显微镜（日产Olympus）、电子天平（上海第二分析仪器厂）、超净工作台（guard型，德国）、水平离心机（LD4-2型，北京医用离心机厂）、γ计数器（MH-01型，中创集团北京民华科技公司研制，中国同位素公司监制）。
1.4 方法
1.4.1 模型复制［1］ 将肺癌荷瘤小鼠脱颈处死，放入75％酒精中浸泡10 min，在超净工作台上分离瘤体，取其中生长良好、无坏死的肿瘤组织，用生理盐水冲洗后剪碎，经0.25%胰蛋白酶室温下消化5 min，用组织匀浆器研磨肿瘤组织制成匀浆过300目尼龙网制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1×107/ml，0.2%台盼蓝染色，在倒置显微镜下计算活细胞数，即未染色的细胞数>95％，在每只小鼠右腋皮下接种瘤细胞悬液0.2 ml。
1.4.2 分组 接种瘤组织前把40只小鼠随机分成4组：空白对照组（A组），荷瘤对照组（B组），抑转丸小剂量组（C组），抑转丸大剂量组（D组）。4组动物分笼喂养。适应性喂养1周后，B、C、D组接种瘤细胞悬液，并于24 h后开始灌胃给药：A、B组用生理盐水0.2 ml/（只·d），C、D组分别用浓度为1.2 g/ml、3.6 g/ml的抑转丸混悬液0.2 ml/（只·d），共灌胃21天。
2 检测项目与方法
2.1 测移植瘤重，计算抑瘤率 处死动物后，剥离移植瘤体，电子天平称重，计算抑瘤率；石蜡包埋，连续切片，厚度约4 μm。抑瘤率（%）＝（对照组瘤重－用药组瘤重）／对照组瘤重×100％。
2.2 观察肺转移数，计算肺转移抑制率 方法同上，取血后颈椎脱臼处死小鼠，剥离小鼠肺脏，用电子天平称重，Buin’s液固定，并计算肺转移结节数，计算肺转移抑制率。
2.3 CD44V6检测
2.3.1 检测方法［2］ 用S－P法，将石蜡切片脱蜡至水化，3%过氧化氢室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗3次，每次2 min，PBS液浸泡5 min，将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中加热，使容器内液体温度保持在92 ℃~98 ℃，并持续15 min，10%正常血清（PBS液稀释）封闭，室温孵育10 min，倾去血清，滴加1∶75的CD44V6抗体4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加生物素标记的二抗工作液，37 ℃湿盒中孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加适量辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37 ℃湿盒中孵育30 min，PBS冲洗3次，每次15 min，DBA显色剂显色，显微镜下观察10 min，适时终止反应，自来水冲洗，苏木素复染，脱水透明，中性树脂胶封闭。
2.3.2 对照 阴性对照以PBS取代一抗，阳性对照为已知的阳性片。
2.3.3 CD44V6结果测定［3，4］ 以细胞膜呈棕黄色为阳性，随机计数5个视野，根据阳性细胞所占比例分为阴性（－）：即阳性细胞数<5％；阳性（＋）：即阳性细胞数≥5％。
2.4 统计学方法 试验结果数据均用均数±标准差（x±s）表示，统计学处理分别用χ2检验和t检验。
3 结果
用药后观察小鼠一般情况，4组小鼠移植瘤均存活并生长，用药过程中各组小鼠活动正常，反应灵活，无毛色枯槁、腹泻、消瘦等，空白组与荷瘤组各1只小鼠在灌胃过程中死亡，尸检为液体灌入气管窒息所致。
3.1 各组出瘤时间比较 见表1。C组和D组的出瘤时间分别与B组比较差异均具有非常非常显著性（P<0.01），C组与D组的出瘤时间比较差异无显著性（P>0.05）。表明：大、小剂量YZP组与荷瘤对照组相比较均能明显延长C57BL／6小鼠的出瘤时间，大剂量YZP与小剂量YZP延缓出瘤时间的作用无差异。表1 各组出瘤时间的比较注：C组、D组与B组对比，*P<0.01；D组与C组对比，△P>0.05
3.2 各组间移植瘤重测量 见表2。C、D组分别与B组的移植瘤重比较，差异有显著性（P<0.05），C与D组的移植瘤重相比较，差异无显著性（P>0.05）。说明大、小剂量YZP对Lewis肺癌的生长均有抑制作用，而大剂量YZP对Lewis肺癌生长的抑制作用与小剂量YZP相比较无差异。表2 各组间移植瘤重的比较注：C组、D组与B组比较，*P<0.05；D组与C组比较，△P>0.05
3.3 各组肺转移灶个数的观察 见表3。C、D组与B组的转移灶个数比较，均差异有显著性（P<0.05），D组与C组的转移灶个数比较，差异无显著性（P>0.05）。表明大、小剂量YZP均能阻抑肺癌的自发转移，大剂量YZP对肺转移的阻抑作用与小剂量YZP无差异。表3 各组间肺转移灶个数比较注：C组、D组与B组比较，*P<0.05；D组与C组比较，△P>0.05
3.4 各组CD44V6阳性表达率观察 见表4。A组无一例表达；A、B、C、D 4组的CD44V6的阳性表达差异有非常显著性（P<0.01）；C、D组分别与B组比较均有差异（C组与B组比较，P<0.05；D组与B组比较，P<0.01）；D与C组比较差异无显著性（P>0.05），表明YZP大、小剂量均能抑制CD44V6的表达，但大剂量YZP降低CD44V6表达的作用与小剂量YZP无差异。表4 各组CD44V6的阳性表达注：B、C、D组与A组比较，*P<0.01；D组与B组比较，△P<0.01；C组与B组比较，▲P<0.05；D组与C组比较，#P>0.05
抑转丸具有阻抑Lewis肺癌生长和自发肺转移的功能，阻碍Lewis肺癌转染的C57BL/6小鼠体内黏附分子的促转移过程；增加剂量并不增加疗效。
4 讨论
4.1 关于肿瘤转移模型的选择 动物肿瘤转移模型有两种：实验性转移模型和自发转移模型，后者更接近人体的转移过程。具有自发性转移能力的可移植性瘤株有多种，资料显示，Lewis肺癌是局部接种肿瘤最易发生转移的小鼠实体瘤，接种成功率为100%，瘤细胞很快转移至肺，转移率为100%。该转移模型具有稳定性、重复性好的特点［5］。
4.2 抑转丸对黏附分子CD44V6表达的影响 有研究表明，宿主的免疫状态可影响肿瘤黏附分子的表达，进而影响肿瘤的转移能力。杨毅等的研究表明免疫系统功能低下或丧失会使CD44表达升高，进而使肿瘤细胞的转移能力加强。本实验结果提示抑转丸可以降低黏附分子CD44V6的表达，其可能机制一方面是对黏附分子CD44V6表达的直接抑制，另一方面可能与提高小鼠自身免疫力，间接影响CD44V6的表达有关。
4.3 抑转丸组方依据及抗肿瘤转移机制探讨 导师陈光伟主任医师根据几十年的临床经验，针对手术切除、放疗、化疗后及晚期肿瘤患者气虚血瘀病机，拟以益气活血为法组方，具有补气活血，扶正培本的作用，有明显抑制肿瘤、提高患者生存质量、延长生存时间的作用，并通过动物实验观察到抑转丸具有抑制肿瘤生长、防止肿瘤复发与转移的作用［1］。本方由西洋参、龟版、鳖甲、莪术、山楂等中药组成，方中西洋参、莪术为君药补气养阴，破血消积，山楂助莪术行气破血散瘀，龟版、鳖甲助西洋参养阴，并能软坚散结共为臣，诸药配合，充分体现益气养阴活血化瘀的扶正祛邪，以扶正为主，佐以祛邪的治则。药理研究证明，西洋参总皂苷Re能增强肿瘤患者的免疫功能，西洋参根多糖可抑制小鼠S180肉瘤的肿瘤生长并能诱导脾细胞产生IL-2、γ-IFN［6］。莪术油制剂在体外对艾氏腹水瘤细胞、小鼠L615白血病及腹水型肝癌细胞等肿瘤瘤株的生长有明显抑制和破坏作用［7］，莪术醇对小鼠肉瘤的细胞核代谢有抑制作用。龟版有抗肿瘤抗突变作用，其提取物对小鼠S180肉瘤和腹水型肝癌细胞有抑制作用［7］。鳖甲粉末对移植性实质性癌具有抑制作用，可使荷瘤小鼠MH134癌肿瘤直径显著减少，肿瘤重量也显著减轻［8］。实验证明山楂提取物金丝桃苷和多酚类化合物是较强的抗癌有效成分，山楂提取液有抑制艾氏腹水瘤细胞的作用［9］。
根据实验结果可以得出，抑转丸能降低黏附分子CD44V6的表达，阻碍Lewis肺癌细胞黏附并浸润到内皮下基膜和ECM，起到抑制Lewis肺癌细胞生长和抗Lewis肺癌细胞自发转移的作用。抑转丸抑制肿瘤转移的可能机制有待于进一步研究。
（本文承蒙陕西中医学院附属医院陈光伟、王希胜老师指导，特此致谢！）
［参考文献］
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