作者：欧阳涛，宋剑南，苗阳，林谦，牛晓红 ，金红，陈冰
【关键词】 ,冠心病
［摘要］ 目的：探讨冠心病（coronary heart disease, CHD）不同痰瘀证候与载脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）基因第4外显子多态性的关系。方法：选择符合条件的CHD痰证、瘀证、痰瘀互阻证和非痰非瘀证（其他证型）患者200例，另选100名健康志愿者作为对照。常规检测所有样品的血脂水平。提取全血DNA，用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism, PCRRFLP）技术检测ApoE基因型。采用SAS软件对基因多态性和痰瘀证候的辨证类型进行相关性分析。结果：（1）冠心病患者中ε4等位基因频率（19.5%）明显高于健康对照组（9.5%），具有统计学意义（P<0.05），其中尤以E 3/4基因型更为多见（P<0.01）。（2）携带ε4等位基因者的总胆固醇（total cholesterol, TC）、总甘油三酯（total triglycerides, TG）和低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol, LDLC）水平明显高于非携带者（P<0.01）。（3）痰证特别是E3/4基因型患者中E3/4型和ε4等位基因的频率明显高于血瘀证患者（P<0.05）。结论：ApoE ε4等位基因是冠心病的危险因素，携带此基因的患者与痰证关系较为密切，推测其可能是CHD痰证的主要易感基因之一。
［关键词］ 冠心病; 载脂蛋白E类; 基因多态性; 痰瘀证候
Study on relationship between polymorphism of apolipoprotein E gene and syndromes of phlegm and blood stasis in patients with coronary heart disease
ABSTRACT Objective: To explore the relationship between polymorphism of apolipoprotein E (ApoE) exon 4 gene and different syndromes in patients with coronary heart disease (CHD). Methods: Two hundred patients with CHD were divided into four groups according to syndrome differentiation, including syndrome of phlegm (PS), syndrome of blood stasis (BSS), syndrome of phlegmblood stasis blocking (PBBS) and syndrome of nonphlegm and nonblood stasis (NPNBS). One hundred healthy volunteers were included in control group. Blood lipids were measured by routine examination. Total DNA of peripheral blood was extracted. ApoE genotypes were determined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) technique. All data were analyzed by SAS software. Results: (1)The occurrence rate of ε4 allele of ApoE in patients with CHD was 19.5%, significantly higher than 9.5% in the control group (P<0.05), and the E 3/4 genotype was especially more frequent (P<0.01). (2) The levels of total cholesterol (TC), total triglycerides (TG) and lowdensity lipoprotein cholesterol (LDLC) in patients with ε4 were higher than those in patients without ε4 (P<0.01). (3) The frequencies of ε4 allele and E3/4 genotype in patients with PS were significantly higher than those in patients with BSS (P<0.05). Conclusion: ApoE ε4 allele, especially E3/4 genotype, is the risk factor of CHD. There is a relatively close relationship between patients with ApoE ε4 allele and PS. It may be one of the main susceptible genes in CHD patients with PS.
KEY WORDS coronary heart disease; apolipoprotein E; gene polymorphism; syndrome of phlegm and blood stasis
载脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）作为脂蛋白的组成部分和功能蛋白，对血脂代谢起调节作用, 编码ApoE基因的变异是影响血浆胆固醇浓度的重要遗传因素之一。已有报道证实：不同遗传背景人群的ApoE的基因多态性通过影响脂质代谢而与冠心病(coronary heart disease, CHD)的发病密切相关［1~3］。证候是中医认识和治疗疾病的根本，冠心病患者的临床表现以血瘀证和痰瘀互阻证为多见［4］。本研究对冠心病不同证候的发生和ApoE基因多态性的相关性进行了探讨，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 病例纳入标准 选择在北京西苑医院和北京东方医院就诊的心肌梗死患者、或经冠状动脉造影及介入治疗确诊为冠心病的患者，这些患者均符合1999年美国心脏病协会AHA/WHO公布的冠心病分型和诊断标准［5］。然后对这些患者进行中医辨证确定证候类型。痰证、血瘀证、痰瘀互阻证、气虚证、阳虚证、阴虚证、气滞证、寒凝证等参考国家技术监督局发布的《中医临床诊疗术语・证候部分》（国家标准GB/T16751.21997）。
1.2 病例排除标准 半年内曾有严重创伤或重大手术者；肾病综合征，甲状腺功能减退症，急性肝胆疾病及糖尿病患者；服用药物影响血脂代谢的患者；正在使用影响血脂代谢药物的患者。
1.3 病例资料 按上述标准纳入不同证候类型的冠心病患者共200例，其中男105例，女95例；平均年龄(63.6±5.8)岁；其中痰证20例（10%），瘀证79例（39.5%），痰瘀互阻证82例（41%），非痰非瘀证19例（9.5%）；身体质量指数（body mass index, BMI）为15.1～34.3 kg/m2。另选100名健康体检者作为对照组，其中男55名，女45名；平均年龄(62.1±7.8)岁；均无冠心病症状，常规心电图及超声心动图检查正常。以上样本人群均来自北京和河北地区，汉族，无血缘关系。所有病例均作标准基线问卷调查，结果记录于按临床流行病学要求设计的表格上。医师、患者和实验研究人员之间实行盲法。
1.4 材料
1.4.1 主要试剂 血清总胆固醇（total cholesterol, TC）和总甘油三酯（total triglycerides, TG）测定试剂盒购自法国申能公司；高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein cholesterol, HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol, LDLC）测定试剂盒由日本第一化学药品株式会社提供；血脂测定多项质控物由卫生部临床检验中心提供；全血DNA纯化试剂盒（Wizard genomic DNA purification kit）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量Marker（PCR Marker和pBR322Hae Ⅲ Marker）以及限制性内切酶HhaI均购自美国Promega公司；丙烯酰胺和NN’甲叉双丙烯酰胺，均购自北京鼎国生物技术公司。
1.4.2 血样采集 患者空腹12 h后，静脉抽取2 ml血样，乙二胺四乙酸抗凝，用于提取DNA。
1.4.3 引物 根据Richard 等［6］设计引物，序列为P1：5’AACAACTGACCCCGGTGGCG 3’；P2：5’ ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC 3’，均由北京鼎国生物技术公司合成。
1.5 方法
1.5.1 血脂水平的测定 测定TG采用胆固醇氧化酶过氧化物酶4氨基安替比林和酚法；测定TC采用脂蛋白脂肪酶甘油磷酸氧化酶过氧化物酶4氨基安替比林和酚法（GPOPAP酶法）；测定HDLC采用选择性抑制法；测定LDLC采用选择性反应法。致动脉粥样硬化指数（atherogenic index, AI）的计算公式为：AI=（TC－HDLC）/HDLC。
1.5.2 ApoE基因型的测定 采用全血DNA纯化试剂盒提取全血DNA。按《现代心脏内科学》［5］中的条件扩增ApoE基因的目的片段。反应体系：10倍缓冲液2 μl，浓度为2 mmol/L的dNTPs 2 μl，二甲基亚砜2 μl，浓度为2 μmol/L的引物各0.25 μl，2 U Taq酶，DNA模板100～200 ng，总体积20 μl。循环条件：95 ℃预变性8 min，然后95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共35个循环后，72 ℃延伸8 min。经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）检验扩增结果。取10 μl PCR产物加入10倍酶切缓冲液2 μl，小牛血清0.2 μl，浓度为10 U/μl的HhaI 0.5μl，去离子水7.3 μl。37 ℃反应4 h。产物用15% PAGE检测其基因型。
1.5.3 样品测序 随机选取各基因型的PCR产物送北京鼎国生物技术公司进行序列测定。
1.6 统计学方法 所有资料均采用SAS软件包进行分析。等位基因频率计算采用频率记数法；基因型，基因分布频率及基因和证候的相关性分析用χ2检验。不同基因型之间血脂的均数比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 ApoE基因目的片段PCR扩增结果 所有300例血样均获得了阳性扩增条带，目的片段分子量为292 bp。见图1。
2.2 PCR产物HhaI酶切分型结果 在300例样品中共检测出6种ApoE基因型，分别为E 3/3、E 4/4、E 2/3、E 2/4、E 2/2、E 3/4型，等位基因分别为ε2、ε3和ε4。见图2。图3为E 4/4型的5’端正向测序结果扫描图。将所有结果与GeneBank中已知的ApoE基因第4外显子对应部分序列进行比对，多态性位点碱基吻合，分型结果准确。
2.3 ApoE基因型与等位基因频率分布 CHD患者中ApoE 3/4基因型和ApoE ε4等位基因频率明显高于健康对照组（P<0.01, P<0.05），OR(Odds Ratio, 优势比也称比值比)值为2.9924，采用MantelHaenszel方法算得95％的可信区间为［1.6508, 5.4242］，使用CochranMantelHaenszel法得到P值为0.0002，表明ε4变异基因和CHD发病显著相关。见表1。
2.4 ApoE基因多态性对血脂水平的影响 分析携带和不携带ε4等位基因患者的血脂水平，结果显示携带ε4等位基因者TC、TG、LDLC和AI明显升高（P<0.05或P<0.01）；而HDLC降低，但无统计学差异。表明ε4等位基因具有“升高血脂”的作用，可加重动脉粥样硬化的程度和提高发病风险。见表2。
2.5 ApoE基因型与等位基因频率在不同证候中的分布 E 3/4基因型和ε4等位基因频率在痰证（syndrome of phlegm, PS）患者中明显高于瘀证（syndrome of blood stasis, BSS）患者(P<0.05)，而E 3/4基因型在非痰非瘀证患者（syndrome of nonphlegm and nonblood stasis, NPNBS）中的频率则明显高于瘀证和痰瘀互阻证（syndrome of phlegmblood stasis blocking, PBBS）患者(P<0.05)，但未见其在ε4等位基因频率间有统计学差异。见表3。
图1 ApoE基因第4外显子目的片段PCR扩增结果电泳图（略）
Fig 1 PCR amplification results of ApoE exon 4 target fragment
M: PCR marker; 1: PCR products; 2: PCR products
图2 ApoE基因第4外显子目的片段PCR产物的HhaI酶切分型结果电泳图（略）
Fig 2 HhaI RFLP results of ApoE exon 4 PCR products
M: pBR322Hae Ⅲ marker; 1: Genotype E 3/3; 2: Genotype E 2/3;3: Genotype E 2/4; 4: Genotype E 2/2; 5: Genotype E 3/4;6: Genotype E 4/4
图3 ApoE E 4/4基因型样品的DNA测序图谱（略）
Fig 3 Sequence mapping of genotype E 4/4 of ApoE
表1 ApoE基因型及等位基因频率分布（略）
Tab 1 Frequency distribution of ApoE exon 4 genotypes and alleles in CHD group and control group
*P<0.05, **P<0.01, vs control group
表 2 ε4等位基因对血脂水平的影响（略）
Tab 2 Comparison of serum lipid level between patients in CHD group with and without ε4 allele
*P<0.05, **P<0.01, vs E 2/2＋E 2/3＋E 3/3 group
表3 各证候组ApoE第4外显子基因型和等位基因频率分布（略）
Tab 3 Frequency distribution of apoE exon 4 genotypes and alleles in CHD patients with different syndromes
*P<0.05, vs PBBS group; △P<0.05, vs BSS group
3 讨论
ApoE是一种富含精氨酸的碱性蛋白，主要在肝内合成及代谢，在血浆脂蛋白代谢、组织修复、抑制血小板聚集、免疫调节、抑制细胞增殖以及老年性痴呆的病理过程中均有重要作用。ApoE的双性α螺旋结构是其结合和转运脂质的基础，ApoE异构体的突变通常发生在两个独立的稳定性不同的结构域中段第112～158氨基酸残基，这些突变大部分都会导致各种高脂血症及其他疾病［7］。具有不同受体结合活性的ApoE异构体必然影响脂质代谢过程：E 4/4表型机体，由于E 4受体结合活性增强，受体代谢途径也增强，极低密度脂蛋白残基清除速率的加速和水平的降低，最终导致血浆TG水平的降低以及TC和LDLC水平的升高，成为动脉粥样硬化的危险因子［8～10］。Song等［10］收集了从1996年到2004年发表的48篇有关CHD与ApoE发病关系相关研究的数据，利用经典的随机效应数学模型对影响CHD发病的种族、性别、ApoE表型、血清脂蛋白水平和其它CHD的易感因素进行了分层分析，结果认为以上不同的结论是由于研究方法、种族、性别或者基因和基因之间的相互作用而导致了不同的结果，但ApoE的ε4等位基因依然是CHD的易感因子，能使CHD发病风险增高42%。在本实验中，我们也得出了相同的结论。
祖国医学认为，冠心病所表现的“胸痹”、“心痛”、“怔忡”等病症，主要是因年老脏衰、饮食不当、情志失调、劳逸失度及外邪内侵等引起。由以上诸多因素所产生的多种病理产物，如痰浊、水饮、瘀血等，导致了心脉痹阻和胸痹心痛。以往的证候调查已证实，冠心病病变程度严重的患者以痰浊证和血瘀证为多见［4,11］。痰浊血瘀是冠心病的重要病机已成为共识［12］，而痰浊血瘀又与脂质代谢紊乱密切相关［13］。ApoE ε4等位基因的携带者更易于发生脂质代谢紊乱，与此基因多态性相关的各种疾病如冠心病、老年痴呆、高血压、糖尿病、肾病综合征等，在中医看来均与痰有关。因此，对ApoE基因多态性与痰瘀之间的关系进行研究，有利于深刻认识痰瘀证候的病因病机［14］。
证候是中医基础理论的核心之一。我们认为，证候是通过四诊（即望、闻、问、切）手段获取的机体在某一时空条件下对各种内外因素（包括机体生理功能及生物、化学、环境、精神、气候等各种致病因子）反应而呈现的生理、病理状态信息综合判断的表述，是体质在特定条件下的表达形式，是机体的一种反应状态（简称反应态）。体质状态决定了证候的产生。而体质是遗传信息转录和翻译后生物体表达的性状，即个体体质是先天禀赋转录的结果，且与后天有密切关系。因此，先天禀赋差异是个体差异的决定因素，是证候易感性和变化趋向性差异的内因，也是同病异证、异证同病形成的根本原因。基因多态性是先天禀赋的重要内容。因此，从结构基因组的角度分析基因多态性与证候的相关性，就能从生理层面预测证候的发生、发展、变化的可能途径，然后按中医“治未病”的观点，及早采取必要的摄生调养方法。
本研究结果表明：ApoE第4外显子的基因型及等位基因频率在冠心病不同中医证候中的分布有明显差异，变异等位基因ε4的携带者TC和LDLC明显升高，更倾向于发生痰证，表明ε4等位基因，特别是E3/4基因型可能是冠心病及中医痰证的主要易感基因之一。因此，密切关注ε4等位基因，特别是E3/4基因型携带者的血脂水平，保持合理的饮食结构和生活方式将有利于防止或延缓冠心病的发生和发展。
（本课题得到北京大学数学科学学院房祥忠教授、硕士研究生李林同学和北京中医药大学博士研究生农一兵同学的大力协助，特此致谢！）
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